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实验方法
葡聚糖凝胶柱层析.（1）sephadexG-200预处理.称取一定量的Sephadex G-200干粉,用去离子水浸泡24h,充分溶胀后装入层析柱中,用 0.1mol/L 的 NaCl 溶液平衡12h；（2）Sephadex G-200 柱层析法.将经DEAE-52纤维素柱层析法分离出的多糖组分,流速条件在 1mL/min下进行洗脱,每管收集2mL.用苯酚硫酸法逐个检测每管收集的多糖溶液,标以收集多糖溶液的收集编号作为横坐,吸光值作为纵坐标绘制洗脱曲线.
蛋白质去除率的单因素实验.（1）反应温度对蛋白质去除率的影响.准确称取10ml多糖溶液,加入浓度为4%的三氯乙酸溶液,分别在20、40、60、80、100℃温度下,控制静止时间在30min,取上清液测定蛋白质含量,计算不同处理温度下所对应的蛋白质去除率；（2）反应时间对蛋白质去除率的影响.准确称取10ml粗多糖溶液,在80℃的水浴锅中处理样品,加入浓度为4%的三氯乙酸溶液,反应时间分别控制在10min、20min、30min、40min、50min,静止,取上清液测定蛋白质含量,计算不同静止时间下所对应的蛋白质去除率；（3）三氯乙酸用量对蛋白质去除率的影响.准确称取10ml粗多糖溶液,在80℃的水浴锅中处理,静止时间控制在30min,三氯乙酸的用量分别控制在1%、3%、5%、7%、9%,取上清液测定蛋白质含量,计算不同三氯乙酸用量下所对应的蛋白质去除率.
实验结果和分析
蛋白质标准曲线的确定.根据蛋白标准曲线蛋白含量含量在20-100mg范围内线性关系良好,相关系数R2等于0.9903,回归方程y 等于1.725x + 0.0039.
多糖纯化.（1）香菇多糖经 Sephadex G-200柱层析结果分析.用纤维素柱层析分析可知,用蒸馏水洗脱出的多糖溶液,在490nm处出现了两个吸峰A和B,其中A峰所占的面积比较大,所以主要成分应该是A峰处的多糖.将收集到的A和B的样品进行冷冻干燥,待使用；（2）香菇多糖经 Sephadex G-200 柱层析结果.称取冷冻干燥后的A、B干粉各100mg,溶于10mL水中,吸取 5mL混合样液于柱中,用蒸馏水作为洗脱液,在流速条件为0.5 mL/min下进行洗脱,每管分别收集5mL,然后用苯酚硫酸法进行检测,重复试验3次,取平均值,制作洗脱曲线.
对所得结果进行分析,在第8管收集的的洗脱液已经可以检测到 A,并且从8-28管逐渐增加,从8至28管A的含量急剧增大,第28管到达最大值,然后又逐渐减小.到48管以后基本检测不出A的存在了.A洗脱出的曲线是一对称峰,由此确定A为单一的物质.同样,B洗出的曲线也呈单一曲线峰,所以也可证明B是单一组分；（3）紫外光谱扫描结果.对 A、B两种组分在190到400nm波段进行紫外光谱扫描,经过分析可知,在211nm处有吸收峰,但在260、280nm处均无吸收峰,由此可以证明在A、B中不含有核酸和蛋白质.
结论
通过Sephadex G-200柱层析对 A和B两种多糖组分进行洗脱,得到的洗脱曲线均呈单一对称峰,说明A和B都是单一的多糖组分.通过对组分进行紫外光谱扫描,通过紫外光谱扫描的结果可知,两个多糖组分中均不含核酸和蛋白质.其中,反应条件为：三氯乙酸用量为5%,反应时间为50min,反应温度为80℃.在此工艺条件下,多糖损失率只有26.7%,而蛋白去除率率可以达到61.8%.
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参考文献：
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