论文甘蔗褐条病病原菌分离鉴定其室内毒力测定是关于甘蔗方面的论文题目、论文提纲、甘蔗糖蜜论文开题报告、文献综述、参考文献的相关大学硕士和本科毕业论文。
摘 要 针对海南省不同植蔗区甘蔗褐条病的典型病斑进行分离培养、单孢纯化、形态学观察、致病性检测以及结合rDNA-ITS序列分析鉴定病原菌.分离到的5株病原菌,经回接实验表明,病原菌HT-4致病性最强,能引起和田间病害一致的症状,将菌株HT-4的rDNA-ITS序列在NCBI上进行BLAST比对.结果表明：菌株HT-4和离蠕孢属（Bipolaris）相似性达到99%,结合形态学分析确定该菌是甘蔗褐条病的病原菌.室内毒力实验表明：在7种供试药剂中,50%咪鲜胺锰盐和10%苯醚甲环唑对病原菌抑制效果最好,EC50值分别为4.400 6 mg/L和9.421 1 mg/L.结果为甘蔗褐条病的防控提供科学参考.
关键词 甘蔗褐条病；离蠕孢属；室内毒力测定；杀菌剂
中图分类号 S435.661 文献标识码 A
世界上已知甘蔗病害有130多种,国内记载有60多种,其中,侵染性病害包括真菌性病害29种,细菌性病害5种,病毒和植原体病害8种,线虫病害8种,寄生性植物2种,其余为非侵染性病害[1-2].甘蔗褐条病是为害甘蔗叶片的一种真菌性病害[3].其病原菌的有性阶段为子囊菌门旋孢腔菌属狭斑旋孢腔菌[Cochliobolus stenospilus（Drechs）Mats et Yam.],目前甘蔗褐条病的有性阶段仅在人工培养基或少数地方（如中国台湾）发现过[4]；无性阶段为半知菌类离蠕孢属甘蔗狭斑离蠕孢菌[Bipolaris stenospila（Drechs）Shoemaker（等于Helminthosporilum stenospilum Drechsler.）][5].甘蔗褐条病于1924年首次在古巴发现[6],至今已有许多国家都有此病害发生的报道.在中国各地蔗区如海南、广东、广西、云南、江西、福建、四川等省（自治区）目前均有发生[5,7].据报道,1975年曾在海南省定安县龙门坡发生了较严重的褐条病,感病蔗株叶片早枯、植株矮小,甘蔗正常生长受到影响[6].前人关于甘蔗褐条病在各植蔗区流行和防治、病原菌分类以及其致病毒素等方面的研究已有相关报道[8-13].迄今,中国对甘蔗褐条病研究还较少,主要局限在病害发生原因、特点及防治措施的研究,而关于甘蔗褐条病病原菌鉴定还未见报道.近年来由于单一甘蔗品种的大面积连作种植,缺乏相应的抗病品种,导致甘蔗褐条病频发和大面积爆发,影响甘蔗的产量和质量.因此,本研究通过对甘蔗褐条病进行分离鉴定及对其进行杀菌剂室内毒力的测定,拟为甘蔗褐条病病害防治策略制定以及进一步培育甘蔗抗病品种提供科学参考.
1 材料和方法
1.1 材料
供试甘蔗病害样本分别取自海南省海口、临高、澄迈、文昌、屯昌、白沙、昌江和定安等植蔗区,取生长健壮的甘蔗植株在实验室大棚中盆栽待用.
供试药剂：50%咪鲜胺锰盐可湿性粉剂（江门市大光明农化有限公司）；70%代森锰锌可湿性粉剂（四川国光农化股份有限公司）；50%多菌灵可湿性粉剂（四川国光农化股份有限公司）；75%百菌清可湿性粉剂（上海亚泰农资有限公司）；70% 硫菌灵可湿性粉剂（江苏龙灯化学有限公司）；10%苯醚甲环唑水分散粒剂（瑞士先正达作物保护有限公司）；65%代森锌可湿性粉剂（上海惠光化学有限公司）.
1.2 方法
1.2.1 病原菌的分离 用常规组织分离法[14]分离病原菌.从蔗区采集表现甘蔗褐条病典型症状的新鲜病叶,用自来水冲洗干净叶片表面,晾干.将病健交界处用手术刀片切成小块病组织（0.5 cm2）,然后在超净工作台中,用70%酒精浸泡20 s,0.1%的升汞溶液中消毒1 min,然后用无菌水清洗3次,置于无菌的滤纸上晾干.将病组织块放入含氨苄青霉素的PDA培养基上,28 ℃恒温培养2～3 d.
待菌落长出后,用接种针挑取菌落边缘的菌丝接种于PDA培养基上28 ℃恒温培养.产孢后进行单孢纯化[15],观察形态特征并根据孢子形态进行鉴定.
1.2.2 病原菌致病性鉴定 将单孢菌株在PDA培养基上培养至长出孢子后,用无菌水制成孢子悬浮液,将其稀释成孢子浓度为1×106个/mL.采用喷雾法,对健康甘蔗叶片接种（喷无菌水作为对照）,套袋保湿24 h,10 d后观察其发病症状是否和田间症状一致,并从发病部位进行病原菌分离,观察孢子的形态特征和原分离菌株的形态特征是否相同.
1.2.3 病原菌的rDNA-ITS序列分析 参照陈吉良等[16]的方法快速高效提取病原菌DNA.引物为真菌通用引物ITS1和ITS4.PCR反应体系为20 μL,包括：10×PCR Buffer 2 μL,2.5 mmol/L dNTPs Mixture 1.6 μL,ITS1和ITS4各1 μL,DNA模板1.5 uL,5 U/μL Taq DNA聚合酶0.1 μL,ddH2O 12.8 μL.PCR扩增程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min,54 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共35个循环；最后72 ℃ 10 min.PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,回收目的片段,并进行连接转化,选取阳性克隆送上海生工生物工程有限公司进行测序,测序结果用BLAST软件进行同源性比对,并用MEGA5.1软件构建系统发育树.
1.2.4 室内毒力的测定 采用菌丝生长速率测定法[17-18],测定7种农药对甘蔗褐条病病原菌的毒力.7种农药药剂都配制成10 g/L的母液,然后分别用无菌水在预实验的基础上配置成5个浓度梯度的药液,将每种药剂不同稀释度的药液分别加入冷却至60 ℃左右的PDA培养基中,制成含药平板,以无菌水为对照.将甘蔗褐条病病原菌在PDA培养基上28 ℃培养6 d.用灭菌的打孔器（内径6 mm）在培养好的褐条病菌菌落边缘打取菌饼.将菌饼分别移到含药平板,每个处理设3次重复.28 ℃恒温培养箱中培养5 d后,采用十字交叉法测量菌落直径,计算抑菌率.
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参考文献：
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