论文真核表达载体pcDNA3.1（）—MyoD—HA—His构建功能检测是关于表达载体方面的的相关大学硕士和相关本科毕业论文以及相关过表达载体论文开题报告范文和职称论文写作参考文献资料下载。
文章编号：10081542（2014）02014905doi：10.7535/hbkd.2014yx02007
摘 要：为了便于检测和纯化转染到非肌肉细胞的生肌因子MyoD,同时为能够和转染的其他生肌因子的表达量进行比较,将MyoD编码区克隆在真核表达载体pcDNA3.1（+）HAHis.测序表明克隆的MyoD序列正确,并和标签序列构成一个开放阅读框；Western blot显示在起始密码子前添加kozak序列GCCGCCACC,可使融合蛋白能够以较高水平表达；生肌转化实验表明,融合蛋白MyoDHA能够有效激活靶基因的表达.
关键词：表达载体；标签；MyoD
中图分类号：Q753 文献标志码：A
Abstract：In order to conveniently detect and purify the myogenic factor MyoD exoexpressed in the nonmuscle cells, and to compare with the expression level of other myogenic factors cotransfected with MyoD, the coding sequence （CDS） of MyoD was cloned and inserted into pcDNA3.1（+）HAHis, an eukarytic expression vector. Sequencing result confirms that the insert is correct and forms the same ORF with the HA and its sequences. Furthermore, Western blot shows that the fusion protein MyoDHA expresses with a high level for the addition of kozak sequence GCCGCCACC,and myogenic conversion demonstrates the fusion protein MyoDHA can activate the target genes effectively.
Key words： expression vector； tag； MyoD
生肌作用（myogenesis）是指多能干细胞经过定向和分化,成为肌细胞,肌细胞之间相互融合为肌管,形成肌纤维的过程.整个过程由生肌因子特异地控制肌特异基因的转录而实现,鉴于此,生肌作用长期以来一直被用做研究真核生物基因表达调控的模式过程[14].
哺乳动物中生肌调节因子有4种：MyoD,Myf5,MRF4和Myogenin,前3个因子均负责把多能干细胞定向为单能的成肌细胞,Myogenin则是在终末分化阶段发挥作用[1,510].这4种生肌因子是转录调控因子[1113].分子水平研究表明,MyoD单独作用便可激活早期肌特异基因.晚期肌特异基因要转录,需先由MyoD结合其调控区域,再由Myogenin替换MyoD；由于这样的一个前馈回路,使得这些基因的表达较晚[14],在这一过程中Myogenin促进晚期基因的染色质重塑[15].
为了进一步探讨MyoD和Myogenin在调控基因表达时的作用及彼此的关系,我们需要在成纤维细胞中表达带有标签的MyoD融合蛋白.一方面这样的蛋白易于检测和纯化,另一方面当跟其他含有同样标签的生肌因子共转染时,有助于衡量不同生肌因子的表达量,而这有助于研究生肌因子作用于靶基因时的相互关系.为准确表达这样的MyoD融合蛋白,本实验选取含有标签HA和His的pcDNA3.1（+）作为目的载体,用以克隆小鼠MyoD的编码区域.
1 实验部分
1.1 试剂和仪器
小鼠的成肌细胞C2C12、成纤维细胞C3H10T1/2和真核表达载体pcDNA3.1（+）HAHis（本室保存）；感受态细菌Trans1T1、高保真Taq（全式金生物技术有限公司提供）；逆转录酶MMLV、转染试剂Lipo 2000和TRIZOL（Invitrogen公司提供）；限制内切酶BamH I和Xho I（宝生物公司提供）；热敏磷酸酶（NEB公司提供）；T4 DNA连接酶（5 U/μL）、普通质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根公司提供）；抗actin抗体和抗HA抗体（中杉公司提供）；氨苄青霉素（索莱宝公司提供）；扩增MyoD编码区域的引物上游5’GCTGGATCCAGGGCCGCCACCATGGAGCTTCTATCGCCGCCACT 3’,下游5’CGATCTCGAGAAGCACCTG ATAAATCG 3’（粗体为保护碱基,粗体下划线为酶切位点,粗斜体为Kozak序列）；检测基因表达的RTPCR引物序列如下：GAPDH上游5’ CAGCCTCGTCCCGTAGACA 3’,下游5’CGCTCCTGGAAGATGGTGAT 3’,Cdh15上游5’GGACCTTCGGGACAACAT 3’,下游5’CAGCCTCCAAGCCATCAC 3’,Myogenin上游5’GAAGCGCAGGCTCAAGAAAGT 3’,下游5’ GATTGTGGGCGTCTGTAGGGT 3’,MCK上游5’CATAAGACCGACCTCAACCACG 3’,下游5’AACCTCCTTCATATTGCCTCCCT 3’,引物和逆转录引物oligo dT由北京六合华大公司合成.
细胞液体基本培养基由粉末状的DMEM培养基（GIBCO公司提供）配制；完全培养基为基本培养基添加体积分数10%胎牛血清（Hyclone）,分化培养基为基本培养基添加体积分数2%马血清（Hyclone）.
总结:这篇表达载体论文范文为免费优秀学术论文范文,可用于相关写作参考。
参考文献：
1、 利用Gateway技术改造原核表达载体pGEX—4T—1、pET—28a 摘 要 质粒载体是基因工程研究中不可或缺的工具。为提高载体构建效率，进一步满足基因工程研究在构建表达载体时的需要，本文提供了一种重组型载体的改造。
2、 吴少东诗（1首） 50°的醉年知天命，开始减去突兀的枝叶，接纳每一阵清风。日常浸润的晨光、阳光与星光于我皆是大福报。这个年岁，我已自觉，见光见光中的万。
3、 商务预报（2月1日） 据商务部监测，上周（1月22日至28日）全国食用农产品市场价格指数比前一周上涨1 5%，生产资料市场价格指数上涨0 1%，结束连续4周下跌趋势。。
4、 熏肠中苯并（α）芘含量测定 摘 要：建立固相萃取-高效液相色谱法测定熏肠中苯并（α）芘的检测方法。样品经Cleanert BaP-3固相萃取柱净化、浓缩，C18色谱柱进行分。
5、 沿海集装箱运价指数走势分析（2018年1月） 天津航运指数下设的沿海集装箱运价指数包括沿海集装箱出港运价指数（以下简称“出港指数”）和沿海集装箱进港运价指数（以下简称“进港指数”）。2018。
6、 核心肌群强化训练（二） 跑步运动中，核心稳定和核心力量的训练是基础。虽然两者都至关重要，但练习时仍有技巧和先后顺序。首先，初级阶段的核心稳定和力量训练，应该遵循由静到动。