论文山羊传染性胸膜肺炎病原快速诊断方法建立是大学硕士与本科胸膜毕业论文开题报告范文和相关优秀学术职称论文参考文献资料下载，关于免费教你怎么写胸膜与腹膜方面论文范文。
摘 要 本文对山羊传染性胸膜肺炎病原进行快速诊断的方法进行阐述,主要包括对山羊亚种的丝状支原体以及绵羊的肺炎支原体的基因特异性引物进行条件及体系的优化反应实验,得到的PCR方法用于监测致病支原体的CCPP,将所建的方法的特异性、敏感性等加以论证,得到的结论是,当引物的浓度达到了1：1 的比例的时候,所建的方法具有较好的特异性,在54摄氏度的时候检除了最小的核酸量,敏感性很好.证明可以在临床上用于诊断.
关键词 山羊传染性胸模肺炎；病原建立；双重PCR
山羊的高度接触性传染病之一就是传染性胸模肺炎,这种被称为烂肺病的传染病死亡率很高,在临床上表现为纤维性肺炎和胸膜炎,经过研究表明,山羊支原体肺炎亚种、丝状亚种、肺炎支原体,均为国内流行的毒株.
在经过对CCPP的诊断方法的选取后,主要选用了分离鉴定病原、血清实验以及分子生物学的技术方法加以鉴定.分离鉴定的在支原体的生长条件的满足方面具有不足,不能促进支原体快速生長,在判断和使用成本均有不利因素.因此无法解决快速诊断的问题.血清学实验的优势在于能够解决简介的血凝实验的差异性的问题,采用补体结合以及敏感竞争的方法,强调了敏感性,但不能诊断病原.分子生物学的方法,优势在于快速、灵敏,简单,而且能够对不同的病原采用多重的PCR进行诊断,因此在实验中最终采用了特异性饮物体的办法,使用生物实验法,针对反应条件等建立了快速、灵敏的检测山羊传染性胸模肺炎病原的方法.为山羊的CCPP防控提供了技术保障.
1 材料与方法
1.1针对国内的微生物的菌种培养进行了提取试剂的培养,包括对支原体进行肉汤培养,提取了DNA试剂,采用微生物菌种资源库的方法进行调取,实验分离鉴定大肠杆菌、链球菌、沙门氏菌等病毒.检验的内容包括了CCPP病死山羊肺组织、胸腔积液以及逼抢的分泌物等.
1.2方法
通过对菌株的DNA采用肉汤培养支原体的方法,将标准株进行培养,在5%的二氧化碳的环境下,将菌液的10ML进行离心30分钟,使用灭菌PBS进行洗涤后,放弃上清,重复洗涤,然后放入适量的悬浮沉淀,按照菌株的DNA提取方法进行零下20摄氏度的保存和备用.
确定好最佳的退火温度后,加入TAG酶、引物灯亮混合模板,补足ddh2o,采用间隔2摄氏度的递增退火的方法,在72摄氏度的时候进行1.5分钟的延伸,确定34个循环后进行退火温度的梯度扩增,确定最佳的退火温度.
去顶反应体系中的最佳的引物浓度,使用不同的退火温度对菌株的DNA的混合模板进行扩增,确定反应体后,按照最佳的扩增条件和反应体系,将特异性的引物按照比例进行梯度的设定,确定好最佳的引物比例后扩增PCR.
进行特异性的监测,检查山羊在临床的表现,包括呼吸障碍,临床高热等,对巴氏杆菌、沙门氏菌等进行PCR扩增,检查凝胶的电泳的检测结果.
采用紫外分光光度法对浓度进行菌株的检测,将菌株按照一定的比例稀释成不同浓度的模板,按照不同浓度的DNA混合模板,将最佳条件进行扩增,获得电泳检测结果.
2 结果
2.1使用50摄氏度的递增的方法进行退火40秒后,PCR扩增,达到了退火的最佳温度,达到54摄氏度的时候,非特异性的条带发生了扩增,效率达到了不同程度的降低,因此54摄氏度成为了最佳的退火温度.
采用菌株的DNA混合模板进行不同浓度的引物的反应体系的哦扩增,在体系中设置好最佳的反应体系以及反应的条件,按照不同的比例进行PCR的扩增,得到了扩增的效果最好.
针对MMC标准株进行的双重PCR的方法,对山羊高热、呼吸障碍等进行病毒和细菌的扩增检测,结果表明,对大肠杆菌、链球菌、沙门氏菌的病毒没有出现条带,说明双重PCR的剪力具有很好的特异性.
经过双重的PCR的监测后,得到了不同浓度的标准柱的模板,检出的PG3的量为0.1ng,临床的病例检查结果根据不同地区送来的疑似CCPP病死羊的病变肺组织以及胸腔的积液的分泌物的分析,表明疑似CCPP病死羊的肺组织中扩增出来的MO核算的特异性条带,在传统的生化鉴定的方法下,只能分离出MO,不能对其他的核酸等加以分离.
3 讨论
在无生命培养基上进行增值,得到了传统细菌学的方法,经过分离和鉴定,临床上具有生长缓慢的特点,而且分离鉴定的成本较高,耗时较长,对疑似的CCPP山羊确定诊断的辅助效果不佳.通过MMC与MO核算的双重PCR方法的监测,通过退火温度的反应的优化,建立了疑似病症的检测,可以检测出特异性和敏感性,用于山羊CCPP病原诊断.资料显示,疫苗免疫方法在MMC和MO免疫原性的存在差异上具有差异性.疑似CCPP病例确诊后采用免疫的方法进行防控是有积极作用.因此根据病原流行的预防控制措施,加以理论研究和实践炎症,为CCPP病原学的研究奠定了坚实的基础.同时设计MMC和MO基因特异性引物,是通过双重PCR方法进行的病原诊断,具有特异性高、敏感性强的特点,可以代替传统的病原分离鉴定,用于临床病例的诊断.
参考文献：
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参考文献：
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