论文橡胶树类萌发素蛋白基因HbGLP01克隆其表达分析是适合不知如何写橡胶树方面的相关专业大学硕士和本科毕业论文以及关于橡胶树的作用论文开题报告范文和相关职称论文写作参考文献资料下载。
摘 要 类萌发素蛋白（GLPs）是一类重要的胁迫响应蛋白,参和植物的多种生理调控过程.试验前期通过cDNA-AFLP技术,从橡胶树转录组中筛选到一个和麻风树JcGLP（XM_012225699.1）高度同源的差异表达片段.在此基础上,通过基因预测和PCR扩增克隆到一个GLPs类基因HbGLP01.该基因包含2个外显子和1个内含子,cDNA全长696 nt,编码231个氨基酸,预测蛋白分子量和等电点分别为24.8 ku和5.54.同源比对表明,该蛋白和麻风树JcGLP1-13蛋白的同源性最高,达到 81%.聚类分析研究表明,该蛋白和JcGLP1-13、胡杨PeGLP1-13及三角叶杨PtGLP等聚为一个分支.qRT-PCR分析发现,多主棒孢病菌侵染能诱导橡胶树HbGLP01基因的上调表达,其中高抗棒孢霉落叶病品种IAN873在侵染后24 h时表达量达到峰值,高感品种PR107在48 h后达到峰值,而且在IAN873中的表达峰值显著高于PR107.
关键词 橡胶树；HbGLP01；表达分析
中图分类号 S794.1 文献标识码 A
多主棒孢（Corynespora cossiicola）侵染引起的棒孢霉落叶病（Corynespora leaf fall disease, CLFD）是世界范围内橡胶种植中的重要病害,在重病胶林区可造成20%～25%的产量损失,但生产中尚无经济有效的防治方法[1].该病于1958年首次在印度发生,目前已遍及亚洲和非洲的主要植胶国[2].中国热带农业科学院环境和植物保护研究所的调查表明,CLFD在中国海南、云南和广东等植胶区普遍发生,其中苗圃地发生尤为严重,且发病面积和为害程度呈逐年加重的趋势[3-6].
类萌发素蛋白（Germin-like proteins,GLPs）是植物中一类和小麦萌发素（germin）蛋白具有高度同源性且位于胞外基质的可溶性糖蛋白,在植物对包括病原侵染在内的逆境胁迫防卫反应中发挥着重要作用[7].GLPs主要以酶、受体和结构蛋白的形式参和多种生理生化过程,能清除植物体内过多的活性氧（ROS）,所催化产生的H2O2可通过选择性地参和信号级联途径来诱导植物的防卫反应,还可以通过纤维素交联作用增强细胞壁的结构,在植物抵抗氧化胁迫过程中起重要作用.国内外研究表明,GLPs类基因的沉默或过表达能显著影响植物抵御某些病原真菌或细菌的能力[8].笔者前期利用cDNA-AFLP技术筛选到一个和橡胶树抗棒孢霉落叶病相关的差异表达片段EST-IAN-FI7321,该片段和麻风树类萌芽素蛋白JcGLP（XM_012225699.1）具有高度的同源性.本文开展了该片段相关基因的克隆及其在抗感橡胶树品种和多主棒孢互作中的表达特性分析,为更好地揭示GLPs类基因在橡胶树中的作用机理以及CLFD防控工作提供理论依据.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株和橡胶树品种 橡胶树品种IAN873及PR107均由中国热带农业科学院橡胶研究所提供,中国热带农业科学院环境和植物保护研究所已证明IAN873对棒孢霉落叶病为高抗,而PR107为高感[9].
橡胶树多主棒孢菌菌株HCCYN49由中国热带农业科学院环境和植物保护研究所提供.
1.1.2 主要试剂 RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司,凝胶回收试剂盒购自美国Omega Bio-Tek公司,PrimeScript RT reagent Kit With gDNAEraser、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）试剂盒、Taq酶、dNTPs、pMD18 -T Vector Kit等生化试剂购自宝生物工程（大连）有限公司,DNA Maker 购自全式金（北京）生物技术有限公司,引物合成和序列测定均由北京六合华大基因有限公司完成.其它试剂均为国产分析纯.
1.2 方法
1.2.1 目的基因的预测和克隆 以前期获得的差异表达序列为靶标,采用Blastn软件和Rahman等[10]所获的橡胶树品种RRIM600全基因组序列进行比对,获得包括该片段在内的大片段序列.通过在线软件Softberry（http：//linux1.softberry.com/）对目的基因序列进行结构分析,根据预测结果设计目的基因上下游引物.
参照安泽伟等[11]的方法提取淡绿期橡胶树叶片总DNA.参照李博勋等[12]的方法选取健康无病的橡胶树叶片进行病原菌接种,于0、6、12、24、48、72 h取样并参照试剂盒说明书进行样品总RNA的提取、纯化和第一链cDNA的合成.电泳检测DNA及RNA样品质量后,参照Li[13]的反应体系和条件,用18S-F和18S-R引物对进行内参基因18S rRNA的扩增以检测各样品第一链cDNA合成质量.
分别用IAN873、PR107的基因组DNA及cDNA为模板,根据预测基因结果设计引物GLP-F：5′-AGGTCAACCTCAACTAACAC-3′和GLP-R：5′-AA
AGAGGCAATAGGCATATC-3′,进行PCR扩增和产物的克隆测序.PCR反应体系为10×PCR buffer（Mg2+ plus）2.5 μL,dNTPs（10 mmol/L）1 μL,Taq DNA polyerase（5 U/μL）0.5 μL,上下游引物（10 mmol/L）各1 μL,模板（50 ng）1 μL,加水补足至25 μL.反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s,55～60 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,35个循环；72 ℃延伸10 min.1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测获得目的片段,经回收连接到pMD18-T载体上,送北京六合华大基因有限公司测序.
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参考文献：
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